بهینه سازی تکنیک pcr برای بررسی خصوصیات ملکولی اینتگرون کلاس یک سویه کلبسیلا پنومونیه در جهت طراحی کیت تشخیصی

چکیده اینتگرون ها از عناصر متحرک ژنتیکی هستند که قادرند ژنهای مقاومت به آنتی بیوتیک های مختلف را حمل نمایند. در میان کلاس های مختلف اینتگرون، اینتگرون کلاس i در ایجاد و انتقال مقاومت های آنتی بیوتیکی مهمتر و دارای فراگیری بیشتری می باشد. نقش اینتگرون ها در بوجود آوردن مقاومت های چندگانه آنتی بیوتیکی نیز ثابت شده است.از طرفی دیگر، کلبسیلا پنومونیه از عوامل مهم عفونت های بیمارستانی و مقاومت های داروئی می باشد. لذا با توجه به اهمیت ژن اینتگرون کلاس i در مقاومت های دارویی و نقش کلبسیلا پنومونیه در عفونت های بیمارستانی، این پژوهش جهت بهینه سازی تکنیک pcr برای بررسی ملکولی دقیق تر اینتگرون کلاس i سویه های کلبسیلا پنومونیه در جهت طراحی کیت تشخیصی می باشد. این مطالعه بر روی سویه های استاندارد atcc1029 klebsiella pneumoniae به عنوان اینتگرون مثبت (c+)و pneumoniae atcc1053 klebsiella به عنوان اینتگرون منفی (c-) و 30 نمونه کلبسیلا پنومونیه جدا شده از محیط و تجهیزات بخش مراقبت های ویژه بیمارستان شهید بهشتی بابل انجام شد. پس از جداسازی و شناسایی کامل باکتری ها، برای بررسی الگوی حساسیت و مقاومت به آنتی بیوتیک های سیپروفلوکسازین، سفازولین، سفتریاکسون، سفتی زوکسیم، سفپیم، سفوتاکسیم، آمیکاسین، اوفلوکسازین، ایمی پنم، تیکارسیلین وجنتامایسین ، تست حساسیت به روش دیسک دیفیوژن صورت گرفت. پس از انجام تست حساسیت، درصد مقاومت به آنتی بیوتیک های فوق به ترتیب 60، 6/86، 3/83، 90، 90، 90، 6/36، 6/56، 60، 6/86 و 6/86 بدست آمد. استخراج dna انجام گردید. ژن اینتگرون کلاس i با استفاده از برنامه pcr و پرایمر بدست آمده از مقالات، تشخیص داده شد. سپس یک جفت پرایمر جدید برای ناحیه inti ژن اینتگرون کلاس i طراحی گردید و pcr مجدد برای تمام سویه های کلبسیلا پنومونیه با این پرایمر طراحی شده انجام شد. با استفاده از پرایمر اولیه، از 30 سویه کلبسیلا پنومونیه جدا شده از icu، 11 سویه (6/36درصد) دارای ژن اینتگرون کلاس i بودند. بهترین دمای annealing برای این پرایمر، که در مقالات 55 درجه سانتی گراد گزارش شده بود، 53 درجه سانتی گراد بدست آمد. با استفاده از پرایمر جدید طراحی شده، از 30 سویه فوق، در 18 مورد (60 درصد) ژن اینتگرون کلاس i شناسایی شد که 11 مورد شناسایی شده با پرایمر اول را نیز در بر می گیرد. نتایج این مطالعه نشان می دهد با استفاده از پرایمر جدید و بهینه سازی صورت گرفته ، می توان درصد بیشتری از سویه های کلینیکی کلبسیلا پنومونیه دارای ژن اینتگرون کلاس i را، در مقایسه با پرایمر موجود، شناسایی کرد. از آنجایی که اینتگرون کلاس i نقش مهمی در ایجاد و انتقال مقاومت آنتی بیوتیکی دارد، شناسایی موارد بیشتر آنها با طراحی کیت های تشخیصی پزشکی حائز اهمیت می باشد. مقاومت آنتی بیوتیکی سویه های کلبسیلا پنومونیه جدا شده از محیط و وسایل icu بسیار بالا بوده که می تواند به دلیل مصرف بی رویه آنتی بیوتیک ها باشد. باید تدابیری اندیشیده شود تا از بروز و انتشار این عنصر مقاومت آنتی بیوتیکی جلوگیری گردد. واژه های کلیدی: کلبسیلا پنومونیه، اینتگرون کلاس i، مقاومت آنتی بیوتیکی، طراحی پرایمر، کیت تشخیصی